共生发酵魔芋飞粉发酵乳中生物活性肽的分离和纯化

朱链链1 伍朝君

乐山职业技术学院 四川 乐山 614000

【摘 要】魔芋飞粉中具有较高的营养价值，包括淀粉、葡甘聚糖等，其使用的营养价值高，但是魔芋本身的特性及口感造成魔芋飞粉食用中口感及味道都较差，经济效益低；对于不同的菌种的影响，有单独菌种或多菌种共同共生发酵，经胃部的消化酶的作用，可以产生对机体有益的肽，调节机体的功能。魔芋飞粉蛋白通过共生发酵法预处理后对于可溶性肽魔芋飞粉支链氨基酸寡肽，然后再进行两步酶解法酶解可溶性肽得到支链氨基酸寡肽。用凝胶层析分离后的魔芋飞粉中寡肽含量14.39%，支链氨基酸寡肽含量28.49%，含量明显提高。支链氨基酸寡肽氨基酸比值1：0.41：0.31，与其支链氨基酸更接近。通过SDS-PAGE 凝胶电泳, 对于可溶性肽的分子量进行确定为10 kD 指标内。

【关键词】共生发酵；魔芋飞粉；发酵乳；生物活性肽；分离；纯化

魔芋飞粉是魔芋精粉在加工过程中，其质量较轻的，颗粒较小的粉末状物质飘飞到研磨器具周围。而魔芋飞粉中具有较高的营养价值，包括淀粉、葡甘聚糖等，其使用的营养价值高，但是魔芋本身的特性及口感造成魔芋飞粉食用中口感及味道都较差，经济效益低，所以会大量的废弃。飞粉为粉末状，一旦废弃容易造成漂浮对空气等造成严重的污染，同时也是对资源的大大浪费。随着技术的不断提高以及深加工艺的利用，基于肠道微生态，菌群的影响及发酵的作用，对于魔芋飞粉中的淀粉等多种物质转化为有机酸等，而增加其乳醇香味。

生物活性肽是一种对机体有益于生命活动的具有生理作用的肽的一种总称，目前根据其功能性的不同分为营养肽，抗氧化肽，生理活性肽等。对于不同的菌种的影响，有单独菌种或多菌种共同共生发酵，经胃部的消化酶的作用，可以产生对机体有益的肽，调节机体的功能。相关的研究也表明共生发酵中含有分子量介于500 ～ 10000D 的肽段, 可以降低结肠癌发生率。本文就魔芋飞粉进行共生发酵生物活性肽的可溶性肽类的提取、分离以及钝化进行深入的研究，对魔芋飞粉在食品以及药品等相关的应用中提供更多种可能，增加其经济效益。

1 实验

1.1 材料

原材料：采用魔芋飞粉（魔芋系鄂品种花魔芋）；

菌种：保加利亚乳酸菌Saccharomyces carlsbergeat is B8，黑曲霉AsPergi l lus niger，葡萄酒酵母Saccharomyces levarum，嗜热链球菌，啤酒酵母。

木瓜蛋白酶，650u/mg；碱性蛋白酶，600u/mg。

1.2 仪器

高速冷冻离心机CR 21G；凝胶层析柱；核酸蛋白检测仪HD-2000 型；BSZ-160 自动部分收集器；SCR-600A 电泳仪；透析纸, 透过分子量3000D 以下；320-S PH计。

1.3 方法

（1）沉淀法提取可溶性肽类

飞粉发酵乳经8 000r/min 4 ℃高速冷冻离心去菌体后, 取上清液, 一边搅拌一边加入(NH4)2SO4 达到一定(4 ℃)饱和度, 加入(NH4)2SO4 的时间应控制在2 h 左右。然后置于冰箱中过夜沉淀，在进行离心操作后去除上层清夜，沉淀用配制的Tris-HCL 缓冲液约20mL溶解清洗。

（2）正交试验最佳比例

通过正交实验, 以淀粉和粗蛋白转化率为优化指标, 五菌共生发酵的种子液的比例1 ∶1 ∶2 ∶2 ∶2 （黑曲霉1：保加利亚乳杆菌1：嗜热链球菌2 ∶葡萄酒酵母2 ∶啤酒酵母2 ）；通过酸碱度PH值为6.0的发酵基质采用10%种量(5 mL)；然后对发酵液进行离心处理，转速为8000r/min,离心操作20分钟后，通过硫酸铵盐析法对其中的可溶性肽进行提取。

（3）酶解法

第一步酶解, 加入碱性蛋白酶，其主要目的是对芳香族氨基酸为端基的肽段的酶解。

第二步酶解，在以上物质中加入木瓜蛋白酶，将芳香族氨基酸水解下来。其指标主要采用酶解液的水解度作为参考标准，继而得到最佳的酶解条件。

魔芋飞粉蛋白采用碱性蛋白酶酶解的最佳条件为:底物质量分数3.75%, 加酶量0.1%, PH9.0, 温度45 ℃, 时间5 h 。

魔芋飞粉蛋白通过木瓜蛋白酶酶解的最佳条件为:加酶量0.1%, PH7.0, 温度40 ℃, 时间4 h 。酶解后在沸水中加热10 min 灭活, 10 000 rmin -1 离心10 min 去酶。取上层清液并在50摄氏度下进行烘干，然后采用浓度为15%的乙醇溶液进行溶解；再离心处理，转速设定同上，然后对上层清夜进行凝胶柱层析。

凝胶层析：寡肽的分子量在200 ～ 600 ，所以在对于凝胶装柱的选择上应选取G-10 ，其特点是分子量的排阻上限为700；然后层析柱型号选择1. 6 cm ×100 cm 。然后样本上样量剂量为5ml，如采用浓度为15%的乙醇溶液进行洗脱，自动核酸蛋白分离层析仪于280 nm处收集, 记录仪纸速选择1 mm /min。对于峰值的收集中，由于寡肽中仍有极少部分的芳香族氨基酸存在，虽然支链氨基酸寡肽在280 nm不存在吸收峰，但仍在较小的区域进行收集。洗脱液经氨基酸自动分析仪检测其氨基酸成分，按照规定严格操作。

2 结果

2.1 单菌生长

本次研究中采用保加利亚乳酸菌，黑曲霉，葡萄酒酵母；采用培养基PH酸碱度6.8。保加利亚乳酸菌属于专性厌氧，采用常规静止培养，培养温度设置35摄氏度，差异浮动1摄氏度左右；其中黑曲霉与葡萄酒酵母菌在摇床上进行培养，这两种菌种的特点兼性厌氧，生长期间会有氧的需求，同时有氧代谢物产生；设置生长温度27摄氏度上下，差异浮动1摄氏度左右；摇床的转速为130r/min。

2.2 单菌生长周期特点

（1）黑曲霉初期24h生长缓慢，36h时菌体生长进入加速期，在62h-73h达到生长的顶峰，然后进入衰落期。

葡萄酒酵母初期24h生长缓慢，36h时菌体生长进入加速期，在62h-73h达到生长的顶峰，然后进入衰落期。

所以以上两种菌在50h时菌落数非常接近，是其两者共生最佳期。

(2）保加利亚乳酸菌在14h之前生长缓慢，在14h-22h时为加速期，然后逐渐趋于平缓。

2.3 氨基酸自动分析结果

魔芋飞粉中寡肽含量14.39%，支链氨基酸寡肽含量28.49%，含量明显提高。

支链氨基酸寡肽氨基酸比值1：0.41：0.31，与其支链氨基酸更接近。见表1。

表1 氨基酸自动分析结果

项目	魔芋飞粉蛋白氨基酸含量	支链氨基酸寡肽氨基酸含量
缬氨酸	27.11	5.32
异亮氨酸	13.92	8.07
亮氨酸	22.09	19.35
酪氨酸	13.39	6.71
支链氨基酸	63.93	34.15
芳香族氨基酸	38.01	10.57
必需氨基酸总和	32.14	56.58
总氨基酸	441.97	127.93
必需氨基酸/总氨基酸	33.01%	47.09%
支链氨基酸/必需氨基酸	45.09%	59.97%
支链氨基酸/总氨基酸	14.39%	28.49%
氨基酸比值	1：0.63：1.39	1：0.41：0.31

3 讨论

生物活性肽是一种对机体有益于生命活动的具有生理作用的肽的一种总称，目前根据其功能性的不同分为营养肽，抗氧化肽，生理活性肽等。对于不同的菌种的影响，有单独菌种或多菌种共同共生发酵，经胃部的消化酶的作用，可以产生对机体有益的肽，调节机体的功能。所以通过共生发酵法对魔芋飞粉进行研究，再运用不同的方法对其进行分析。

魔芋飞粉通过共生发酵法预处理后得到可溶性肽，然后再进行两步酶解法酶解可溶性肽得到支链氨基酸寡肽。用凝胶层析分离后的魔芋飞粉中寡肽含量14.39%，支链氨基酸寡肽含量28.49%，含量明显提高。支链氨基酸寡肽氨基酸比值1：0.41：0.31，与其支链氨基酸更接近。通过SDS-PAGE 凝胶电泳, 对于可溶性肽的分子量进行确定为10 kD 指标内；本次实验中针对可溶性肽的分子量范围较大的因素，所以对于不同分子量分布的肽段只收集两个，在今后的研究中仍亟需相关深入研究。

参考文献：

[1] 邹庭, 刘建富, 张志健. 魔芋飞粉生物碱提取技术研究[J]. 中国食品添加剂, 2018(5).

[2] 耿胜荣, 徐晨, 李海蓝,等. 魔芋飞粉/淀粉基共混膜的制备及性能研究[J]. 湖北农业科学, 2017, 56(13):2512-2515.

[3] McCleary B V.Methods in Protain [ J] .Academic Press,2002 , 160 :596 ～ 610

[4] 姜莉, 徐怀德, 王莉,等. 碱性蛋白酶酶解魔芋飞粉制备抗氧化多肽[J]. 中国食品学报, 2015, 15(5):90-95.

[5] 黄林青, 许圆, 佘楚芬. 魔芋飞粉与卡拉胶共混凝胶特性及其应用[J]. 食品安全导刊, 2017(21):66-66.

[6] 毛跟年, 张轲易, 吕婧,等. 魔芋飞粉的应用现状及展望[J]. 食品工业, 2015(1):244-247.

[7] 毛跟年, 贾莹, 张诗韵. 魔芋甘露聚糖肽的分离纯化[J]. 食品工业科技, 2015, 36(24):243-246.

[8] 宋刚, 干信. 共生发酵魔芋飞粉制备甘露聚糖肽及其性能检测[J]. 化学与生物工程, 2008, 25(5):39-42.

基金项目：乐山市科技局重点研究项目（课题编号：16NZD053）

作者简介：朱链链（1986－），女，四川大邑人，乐山职业技术学院，讲师，硕士研究生，主要研究方向：药物分析