黄芪多糖对结直肠癌LOVO细胞生长的影响研究
肖 娟 千新来*
新乡医学院 河南 新乡 453003
【摘 要】2012年全球结直肠癌发病率（新发病例136万例，死亡694000例）位居所有恶性肿瘤第三位，总死亡人数694000，占恶性肿瘤总死亡人数8.5%。中药黄芪的主要活性成分是黄芪多糖(APS)，尚未见APS对结直肠癌LOVO细胞生长能力的影响及相关机制的研究报道。本文主要分析研究APS对结直肠癌LOVO细胞生长的影响。
【关键词】黄芪多糖；LOVO细胞；直肠癌；细胞生长；研究
1 研究背景
世界卫生组织（World Health Organization，WHO）全球肿瘤流行病学统计数据（global cancer epidemiology statistics，GLOBOCAN）显示，2012年全球新发恶性肿瘤病例1410万例，死亡820万例。其中结直肠癌（新发病例136万例，死亡694000例）位居第三位。世界范围内，结直肠癌占2012年男性恶性肿瘤的第三位（新发病例746000例，占10%）、女性的第二位（新发病例614000例，9.2%）。世界发达地区（55%）结直肠癌的发病率高于欠发达地区（45%）。无论男性还是女性，世界范围内，均以澳大利亚和新西兰发病率最高，西非最低。2012年结直肠癌的总死亡人数为694000，占恶性肿瘤总死亡人数的8.5%，但在欠发达地区（52%），结直肠癌的死亡率高于发达地区（48%）。因此，积极探索结直肠癌治疗的新技术和新药物是提高结直肠癌患者治疗效果的关键。
2 国内外研究现状及分析
与其它中晚期恶性肿瘤一样，化疗是中晚期结直肠癌的主要治疗手段之一。尽管目前的化学药物抗肿瘤作用确切，但是存在严重副作用、长期用药可产生耐药性等缺陷。近年来，随着对中药研究的深入，已经发现一些重要具有明显的抗肿瘤作用，且毒副作用小。值得重视的是，天然植物中具有抗肿瘤作用且低毒性的活性成分研究正越来越受关注。对中药药理作用的研究结果显示，补益类中药中具有抗肿瘤作用的活性成分主要是其多糖成分，后者可通过调节机体免疫等机制而发挥抗肿瘤作用。
常用中药黄芪（Astragalus membranaceus）属豆科黄芪属植物，黄芪多糖（Astragalus Polydsaccharide，APS）是其的主要活性成分之一。研究发现APS具有多种免疫增强作用，可作为免疫调节剂和促进剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。在APS抗肿瘤方面的研究发现，APS可抑制乳腺癌、胃癌、白血病等实体瘤或瘤细胞株的生长。在APS抗肿瘤机制方面的研究发现，一方面APS可通过提高实验动物淋巴细胞免疫活性发挥看肿瘤作用；另一方面APS可通过调节细胞周期、血管生成、端粒酶活性、凋亡相关蛋白的表达等机制发挥抗肿瘤作用。提示，APS的抗肿瘤作用机制可能比较复杂。
目前，尚未见APS对结直肠癌LOVO细胞生长能力的影响及相关机制的研究报道。
本研究拟制备APS并定量，采用不同浓度的APS处理结直肠癌LOVO细胞，通过四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色方法绘制细胞生长曲线，观察APS对结直肠癌LOVO细胞生长速度和倍增时间的影响；通过流式细胞术观察APS对结直肠癌LOVO细胞周期分布的影响；通过平板克隆形成实验观察APS对结直肠癌LOVO细胞克隆形成的影响。通过Western blotting方法检测APS处理前后结直肠癌LOVO细胞中细胞周期蛋白A、B、E（cyclin A、B、E）和p21等细胞增殖相关基因表达的变化。以期为APS用于结直肠癌的治疗提供实验依据。
2.1 对免疫系统的作用
2.1.1对非特异性免疫功能的影响
黄芪多糖(APS)可显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能，使小白鼠吞噬绵羊红细胞百分率及指数明显增强，促进血清溶血素形成，提高空斑形成细胞的溶血功能和明显的碳离廓作用、明显增加脾重量。进一步分离黄芪多糖得到3种单体多糖:123,分别进行实验,结果是多糖1能增加脾重量及细胞数,但抑制脾细胞对绵羊红细胞的免疫应答反应。2与1相似但较弱，多糖3没有作用。黄芪皂苷能促进淋巴结B细胞增殖分化和浆细胞抗体形成。黄芪能促进小鼠淋巴细胞对羊血球的免疫特异玫瑰花结的形成。黄芪多糖明显增强巨噬细胞吞噬发光强度并抑制PGE2的释放，但进一步促进TNF的释放。环氧化酶抑制布洛芬则明显抑制PGE2和TNF的释放，对吞噬功能无明显影响。因此可以提示免疫激活剂和环氧化酶抑制剂的组合，可望成为创伤感染药物治疗的新方案。
2.1.2 对体液免疫作用
黄芪对正常机体的抗体生成功能有明显促进作用。黄芪在体液免疫，增强单核巨噬细胞的吞噬活性，对体细胞，自然杀伤细胞释放免疫活性物质，诱生干扰素，白细胞介素等多方面表现出多种生理活性。其抗病毒的原理之一可能是提高患者白细胞诱生干扰素的能力，正常人服用黄芪全草浸膏片后IgE3显著增加。黄芪能促进巨噬细胞的吞噬功能，能促进B细胞的增殖并且抑制总补体活性。对白细胞介素的产生有诱生作用，促进小鼠淋巴细胞对羊血球的免疫特异性玫瑰花结形成、对免疫抑制剂造成的免疫功能低下有明显的保护作用，是具有双向作用的免疫调节剂。黄芪多糖是黄芪中免疫活性较强的一类物质它能增强吞噬细胞的吞噬功能，从脾及胸腺重量，溶血素、血凝素以及脾细胞总数及空斑形成细胞测定看出，黄芪多糖、红芪多糖均能对环磷酸胺或强的松龙的免疫抑制作用有完全及部分对抗作用。
2.1.3 对细胞免疫的作用黄芪可促进体细胞免疫功能
其增强人血淋巴细胞免疫功能的作用可能是由于部分地降低了抑制性T细胞活性的结果。黄芪多糖可通过调节含量以及促进磷脂酰肌醇代谢，进而提高创伤后活化T淋巴细胞内IL-2mRNA及IL-2RmRNA的基因转录表达，这可能是黄芪多糖纠正创伤后细胞免疫功能低下的机理之一。黄芪对T细胞及其分泌的细胞因子的调节作用可能与其调节IgG亚类的产生有关。
2.2 对机体代谢的影响
2.2.1 对细胞代谢的影响
通过观察人胎肾细胞,人胎肺二倍体细胞及小鼠肾细胞在含黄芪的营养液中生长发现黄芪可使细胞的生理代谢作用增强。小鼠水煎液及正常人服用黄芪干浸膏片后，血浆CAMp含量均明显提高。小鼠SC黄芪注射液，可显著增加白细胞总数和多核白细胞数。黄芪还能促进各类血细胞的生成、发育及成熟过程，促进骨髓的造血功能。对体外培养肝细胞，黄芪能促进RNA及蛋白质合成，提示其能延长细胞寿命，增强细胞代谢推迟老化。
2.2.2 对核酸代谢的影响
黄芪多糖(APS)抑制游离RN-ase的活力的程度是：肾＜肝＜肺＜脾，此结果应用平衡反应的相对增加速度来解释，APS的作用在低RI组织表现显著。黄芪对人肺二倍体细胞的RNA代谢有抑制作用，黄芪煎剂可显著促进骨髓造血细胞DNA的合成，加快有核细胞分裂过程。黄芪皂苷能使再生肝DNA含量明显增加，黄芪多糖对DNA的代谢无明显的影响。
3 研究的目的、意义
研究APS对结直肠癌LOVO细胞生长能力及结直肠癌LOVO细胞中增殖相关基因表达的影响，为APS用于结直肠癌的治疗提供实验依据，以提高结直肠癌患者的疗效、改善患者的生存质量。
4 研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题
4.1 研究内容
（1）研究APS对结直肠癌LOVO细胞生长能力的影响。
（2）检测APS处理前后结直肠癌LOVO细胞中cyclin A、cyclinB、cyclinE和p21等细胞增殖相关基因表达的变化。
4.2 研究目标
探讨APS对结直肠癌LOVO细胞生长能力的影响及机制，为为APS用于肝癌的治疗提供实验依据。
4.3 拟解决的关键问题
拟解决的关键问题：APS对结直肠癌LOVO细胞生长能力的影响及其机制。
解决措施：①通过细胞生长曲线、流式细胞术、平板克隆形成实验观察APS对结直肠癌LOVO细胞生长能力的影响；②通过Western blotting方法检测APS处理前后结直肠癌LOVO细胞中cyclin A、cyclinB、cyclinE和p21等细胞增殖相关基因表达的变化。
5 研究方案
5.1 制备APS水溶液并定量。
5.2 常规培养结直肠癌LOVO细胞，用不同浓度的APS处理结直肠癌LOVO细胞。
5.3 通过MTT比色方法绘制细胞生长曲线，观察APS对结直肠癌LOVO细胞生长速度和倍增时间的影响。
5.4 细胞周期同步化后，通过流式细胞术观察APS对结直肠癌LOVO细胞周期分布的影响。
5.5 通过平板克隆形成实验观察APS对结直肠癌LOVO细胞克隆形成的影响。
5.6 提取细胞总蛋白并定量，通过Western blotting方法检测APS处理前后结直肠癌LOVO细胞中cyclin A、cyclinB、cyclinE和p21等细胞增殖相关基因表达的变化。
6 结论
通过观察APS对结直肠癌LOVO细胞生长能力及增殖相关基因表达的影响，为APS用于结直肠癌的治疗提供实验依据。
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作者简介：第一作者，肖 娟（1986-），女，在读硕士研究生，实验师，主要从事一线护理和基础医学实训室管理等方面的工作。
通讯作者：千新来(1966-), 男，博士，新乡医学院研究生导师，研究方向为肿瘤分子病理与肿瘤生物临床病理