加味青蒲饮联合奥美拉唑对小鼠幽门螺杆菌感染的
清除作用及对胃黏膜炎症的影响

仇晓夏 金小晶 范乃兵3

1.江苏省南通卫生高等职业技术学校 江苏 南通 226000
2.南京中医药大学附属第三医院 脾胃科 江苏 南京 210001
3.南京中医药大学 江苏 南京 210001

【摘 要】目的： 探讨加味青蒲饮联合奥美拉唑对幽门螺杆菌（Helicobacter.pylori，Hp）相关性胃病的作用机制，以期寻找出与抗生素疗效相当的中药复方。方法：60只C57BL/6小鼠采用NaHCO3联合Hp灌胃的方法制作Hp感染小鼠模型，随机分为模型组、中西药结合低剂量组、中西药结合中剂量组、中西药结合高剂量组、中药复方组、西药三联组,每组10只，各组分别给予对应处理，停药4周后观察小鼠胃黏膜Hp定植和胃黏膜病理改变情况。 结果：加味青蒲饮联合奥美拉唑对Hp有一定的清除作用，与剂量正相关，但疗效不如西药三联组；在胃粘膜病理改善方面，中西药结合低、中、高剂量组、中药复方组疗效均显著(P＜0.05),且中西药结合中、高剂量组、中药复方组与西药三联组无显著差异（P﹥0.05）；中西药结合高剂量组与中药复方组相比，在清除Hp方面差异显著(P＜0.05)。 结论：加味青蒲饮联合奥美拉唑对小鼠Hp感染有一定的清除作用,与剂量正相关，对胃黏膜炎症有明显改善作用，但目前尚不能取代抗生素在清除Hp方面的作用。

【关键词】加味青蒲饮；幽门螺杆菌；胃黏膜炎症

自1983年澳大利亚学者Warren和Marshall[1]在人胃粘膜组织中发现并分离出Hp来，人们逐渐发现Hp与人类的胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的发生发展密切相关，并且WHO已将Hp列为第一级致癌物质[2]。因此，对Hp相关性胃病的积极治疗显得尤为重要。目前临床推荐的西药治疗方面，由于抗生素的广泛应用，发现了药物不良反应及Hp耐药株产生等问题，使其应用受限。而较多文献资料显示中药治疗Hp相关性胃病有一定的优势，主要表现在疗效显著、愈后复发率低、副作用少、长期应用无耐药性等方面。因此我们建立了Hp感染的小鼠动物模型,从清除Hp和保护胃黏膜的角度，对加味青蒲饮联合奥美拉唑治疗Hp相关性胃病的疗效进行客观评价，以期寻找出切实有效的，甚至与抗生素作用相当可替代治疗的中药复方，进而最大限度的发挥中医药在现代疾病治疗中的优势与特色。

1 材料

1.1 动物

SPF级C57BL/6小鼠60只,雌雄各半,体重20±2g,实验鼠饲料与垫料均为SPF级，均由南京中医药大学动物实验中心提供。小鼠雌雄分笼饲养,每笼5只，每天自由饮水及进食颗粒饲料。

1.2 药品及试剂

加味青蒲饮由川连、蒲公英、木香、连翘、槟榔、红藤和百合组成,草药饮片均购自南京市中医院门诊部药房。根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”[3]换算的等效剂量为中剂量，低剂量、高剂量分别为中剂量的1/2、2倍。中药煎剂由南京中医药大学动物实验中心制备,水煎后浓缩配制成低剂量0.37g/ml、中剂量0.74g/ml、高剂量1.48g/ml 3种浓度。奥美拉唑片(常州四药制药有限公司生产,批号: 120417):20mg/片,用蒸馏水配成浓度为0.26mg/ml的混悬液备用。克拉霉素片(江苏恒瑞医药股份有限公司生产,批号: 12051653):500mg/片,用蒸馏水配成浓度为6.50mg/ml的混悬液备用。阿莫西林(联邦制药生产,批号: 20505011):500mg/片,用蒸馏水配成浓度为13.0mg/ml的混悬液备用。胃幽门螺杆菌pH指示剂法诊断试剂盒(上海惠泰医疗科技公司生产,批号: 20120321)。

2 方法

2.1 Hp菌株及培养

采用I型Hp菌株,该菌株含有空泡细胞毒素(VacA)和细胞毒素相关蛋白(CagA),由江苏省人民医院实验中心提供。培养基为含有马血清60mL／L、盐酸万古霉素10mL／L、两性霉素B 10mL／L、多粘菌素B 0.5mL／L、甲氧苄胺嘧啶0.5mL／L的哥伦比亚固体培养基，将菌种接种于该培养基上，于37℃、微需氧（5％O2、10％CO2、85％N2)条件下培养72h。收集Hp菌落于无菌生理盐水制成混悬液，调整菌悬液终浓度为1×109CFU/mL。（收集Hp菌落前需进行Hp的鉴定，包括菌落形态、尿素酶试验和革兰氏染色。）

2.2 动物造模[4-7]

100只小鼠进入无菌室后适应性饲养5天，第6天禁食12小时后用灌胃器喂以5% NaHCO3 0.5 mL，30min后再灌饲1×109CFU／mL的Hp菌株、0.5mL/只，2小时后给食。隔日一次，共5次。于末次接种后第4周, 随机抽取6只小鼠（雌雄各半），禁食12h后将其处死，取出鼠胃,沿胃大弯将胃剖开,用无菌生理盐水冲洗胃内容物,纵向分成2份, 其中1块组织行快速尿素酶检测, 1块组织经石蜡包埋、切片后行碱性品红染色进行Hp检查。2种检测方法均为阳性即诊断为Hp感染。根据预实验的结果，末次接种菌株4周后小鼠造模成功率可达到100%。

2.3 动物分组

末次菌株接种4周后，小鼠先按体重分层，再随机分为6组，各组分别做好标记：第一组为模型组，第二、三、四组分别为中西药结合低、中、高剂量组（加味青蒲饮+奥美拉唑混悬液组），第五组为中药复方组（加味青蒲饮中剂量组），第六组为西药三联组（奥美拉唑+克拉霉素+阿莫西林混悬液组），每组10只，雌雄各半。

2.4 给药方法

造模后4周开始灌胃给药，第一组灌胃蒸馏水，第二组至第四组先灌胃奥美拉唑混悬液，30min后各组再分别灌胃低、中、高剂量的加味青蒲饮水煎剂，第五组灌胃中剂量加味青蒲饮水煎剂，第六组先灌胃奥美拉唑混悬液，30min后再灌胃克拉霉素和阿莫西林的混悬液，每日1次，共2周。给药体积：0.2mL/10g。

2.5 观察指标及方法

停药4周后，将实验小鼠用颈椎脱臼法处死，剖腹取出胃组织，沿胃大弯纵行剖开，用灭菌生理盐水洗去胃内容物，取胃窦部小弯侧组织1块行快速尿素酶试验。然后将标本置于10%甲醛溶液中固定，石腊包埋，常规HE染色，光镜下观察组织病理学变化，碱性品红染色后观察Hp定植情况。

①快速尿素酶试验按试剂盒操作说明进行。②胃黏膜组织学改变（HE染色）胃黏膜组织病理学判定标准参照新悉尼系统及2006年《中国慢性胃炎共识意见》[8]制定：轻度：慢性炎症细胞较少并局限于黏膜浅层，不超过黏膜层的1/3，偶见中性粒细胞，计1分；中度：慢性炎症细胞较密集，不超过黏膜层2/3，中性粒细胞较多存在于黏膜层，可见于表面上皮细胞、小凹上皮细胞或腺管上皮内，计2分；重度：慢性炎症细胞密集，占据黏膜全层，中性粒细胞较密集，或除中度所见外还可见小凹脓肿，计3分。③ Hp定植标准评分[9]： 高倍镜下观察10个视野胃小凹的Hp定植情况，以定植量多少记分；0=无Hp定植；1=胃小凹由l～2条Hp，但不是每个胃小凹都有细菌存在；2=多数胃小凹由3～l0条Hp；3=几乎所有胃小凹都有成堆的Hp。

2.6 统计学方法

采用SPSS17.0统计分析软件,率的比较用x2检验,计量资料符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布的采用秩和检验（Wilcoxon秩和检验），计数资料采用方差分析(F检验)。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组快速尿素酶试验阳性率比较

表1示：西药组与模型组比较,阳性率有统计学意义(P＜0.05)，其余各组与模型组差异无统计学意义(P＞0.05)，但中西药结合低、中、高剂量组与模型组相比的P值逐渐趋向于0.05，与剂量呈正相关性。中西药结合高剂量组与西药组相比无统计学差异(P＞0.05)。

3.2 各组小鼠胃黏膜组织Hp定植积分和病理积分比较

表2示：与模型组比较，在Hp定植积分方面，除中西药结合低剂量组外，其余各组均与其有统计学差异(P＜0.05)；在病理积分方面，各组均与其有统计学差异(P＜0.05)。与西药组比较，在病理积分方面，中西药中、高剂量组及中药组与其均无统计学差异(P＞0.05)。中西药结合组与中药组比较，在Hp定植积分方面，中西药高剂量组与其有统计学差异( P＜0.05)。

表1 各组小鼠快速尿素酶试验阳性率比较

组别	根除Hp小鼠数（只）	未根除Hp小鼠数（只）	合计（只）	根除率（%）
模型组	0	10	10	0△
中西药组（低）	0	10	10	0△
中西药组（中）	1	9	10	10△
中西药组（高）	3	7	10	30
中药复方组	0	10	10	0△
西药组	7	3	10	70*
合计	11	49	60	18

注：与模型组比较，* P＜0.05；与西药三联组比较,△P＜0.05；与中药复方组比较,▲P＜0.05

表2 各组小鼠胃黏膜Hp定植积分和病理积分比较 (分，x±s)

组别	鼠数	Hp定植积分	病理积分
模型组	10	2.90±0.32△	2.00±0.67△
中西药组（低）	10	2.70±0.48△	1.30±0.48*△▲
中西药组（中）	10	2.00±0.82*△	1.10±0.32*
中西药组（高）	10	1.40±0.97*△▲	1.00±0.00*
中药复方组	10	2.20±0.42*△	1.00±0.00*
西药三联组	10	0.40±0.70*	1.00±0.00*

注：与模型组比较，* P＜0.05；与西药三联组比较,△P＜0.05；与中药组比较,▲P＜0.05

3.3 胃黏膜组织病理观察

镜下可见模型组小鼠胃粘膜糜烂，胃腺体排列不整齐，见大量炎性细胞浸润，部分组织损伤；中西药结合高剂量组胃腺体排列整齐，见极少量炎性细胞浸润；中西药结合中剂量组胃腺体排列比较整齐，见少量炎性细胞浸润；中西药结合低剂量组胃粘膜糜烂，胃腺体排列不整齐，见大量炎性细胞浸润；西药组胃腺体排列整齐，极少炎性细胞浸润，基本无组织损伤；中药复方组胃粘膜糜烂，胃腺体排列不整齐，见大量炎性细胞浸润。

3 问题及展望

该实验表明，加味青蒲饮联合奥美拉唑对Hp有一定的的清除作用，与剂量正相关。虽然其根除效果不如西药组显著，但对Hp感染小鼠胃黏膜具有较好的保护作用，能够显著改善其病理变化，在该方面与西药组无明显差异(P＞0.05)。该实验还分设了中西药结合组和中药复方组，相关结果表明在清除Hp方面前者优于后者，提示中西药结合能够提高治疗Hp相关性胃病的疗效,对临床具有一定的指导意义。

该研究目前尚不能证明加味青蒲饮能够完全取代抗生素在清除Hp方面的作用，不能排除如下原因：①剂量不足：目前临床用于清除Hp的抗生素的剂量远远高于常规剂量，而中药剂量为常规用量，并且该实验相关数据也提示中药清除Hp的疗效与剂量正相关；②疗程不足：中医治疗关注的重点不在于人体感染了何种细菌、何种病毒或何种其他的致病因素，而在于这些致病因素作用于人体之后所产生的反应，侧重于从整体上调整机体阴阳以达到治病求本，从而中医治疗的疗程相对较长，有时不如西药起效快；③Hp感染的证候模型缺乏：辨证论治是中医治病的特点之一，而加味青蒲饮是在长期临床实践指导下，针对Hp相关性胃病的主要病机特点——湿热内蕴所获得的处方，然而目前缺乏Hp感染的证候模型，从而使实验研究的科学性和可靠性受到限制；④菌株的差异：不同菌株感染动物模型致胃粘膜损伤机制不同，对药物的敏感性亦有所不同，本实验仅仅将1型Hp作为接种菌株，实验结果尚缺乏全面性。

参考文献：

[1] Jr W,Bj M.Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis[J].Lancet,1983,1(8336):1273-1275.

[2] Fuccio L,Eusebi LH,Zagari RM,et a1.Helicobacter pylori eradication treatment reduces but does not abolish the risk of gastric cancer[J].Am J Gastroenterol,2009,104(12):3101-3102.

[3] 赵伟,孙国志.不同种实验动物间用药量换算[J].实验动物，2010,5:2-53.

[4] 李岩,王江滨,焦健,等.不同品系小鼠幽门螺杆菌感染实验模型的建立及其病理特征的比较[J].中国实验诊断学,2007,11(4):537-538.

[5] 罗萍,周曾芬.建立幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠动物模型[J].实用临床医药杂志,2013,17(1):34-36.

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[9] Lee A,O’ Rourke J,De Ungria Mc,et al.A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection :Introducing the Sydney strain[J]. Gastroenterology,1997,112:1368-1397.