荧光定量PCR检测HIV病毒载量两种核酸提取法的
检测要点

漆兆李

大英县疾病预防控制中心 四川 大英 629300

HIV病毒（人类免疫缺陷病毒）即为艾滋病病毒，是引起人们免疫系统缺陷的一种疾病。此病症在1981年美国首次被发现，是感染人们免疫系统细胞的慢性病毒，临床将其叫做逆转录病毒。HIV病毒主要对人体的辅助T淋巴细胞系统进行攻击，当其进入人体细胞后，病毒会快速与细胞整合在一起，终生消除不了。此病毒存在于感染者的精液、血液、乳汁、阴道分泌物、脑脊液、脑组织液中，特别是血液、阴道分泌物、精液中浓度最高。其对外界环境抵抗力较弱，感染者潜伏期较长，死亡率较高，同时传染率也较高，因此，尽早对人类免疫缺陷病毒进行检测，明确病情后，早期给予针对性干预治疗，控制病情的同时预防传染。目前，在人类免疫缺陷病毒载量检测中，多采用荧光定量PCR检测，但在检测过程中，不同的核酸提取法，所产生的检测效果不同。目前，人们对于荧光定量PCR检测HIV病毒载量两种核酸提取法的检测要点不了解，易于检测时，出现不同的反应，因此，今天我们就针对荧光定量PCR检测HIV病毒载量两种核酸提取法的检测要点进行讨论一下，以此来提高人们对人类免疫缺陷病毒的认知。

1 HIV病毒载量检测意义

针对人类免疫缺陷病毒感染病人与艾滋病病人实施定量检测是通过对人们血浆中的人类免疫缺陷病毒载量进行检测，观察与了解人类免疫缺陷病毒感染病人与艾滋病病人的病程进展，因此，对人类免疫缺陷病毒感染病人与艾滋病病人开展病毒载量检测具有积极意义。

2 HIV病毒载量检测方法

人类免疫缺陷病毒载量检测技术与试剂盒主要掌握在欧美发达国家，主要是因为成本原因，检测试剂盒难以在发展中国家应用。但随着艾滋病病毒感染者、艾滋病患者的增加，使得病毒载量检测在适合国情的基础上，非常有必要。目前，荧光定量PCR检测HIV病毒载量被广泛应用于临床检测中，其具有操作简单、易掌握等优点，但在检测过程中，需要不断提高试剂盒的检测敏感度、特异性，从而达到进口检测水平。同时在荧光定量PCR检测HIV病毒载量中，因不同的核酸提取法，所产生的效果不同。核酸提取法有氯仿-异丙醇方法、核酸提取柱方法，由两种方法提取人类免疫缺陷病毒中的RNA，但两种核酸提取中，会受不同因素的影响，因此，对两种核酸提取方法中的检测要点展开讨论。

3 两种核酸提取方法

3.1 氯仿-异丙醇方法

在样本中，加入裂酸液（130ul），同时加入氯仿（50ul），将其混合后，开展离心处理（12000rmp），离心15分钟为宜，并在同样数量的离心管中，注入异丙醇（100ul），在各管中加入离心处理后的上清液，离心处理（12000rmp）15分钟，去除上清液，注入乙醇 （250ul，70%）实施洗涤，同时做离心处理10分钟，除去上清液后，再次进行离心处理（4000rmp），充分吸干残余的液体，但在皮过程中，需要注意不能出现沉淀。并需要在室温环境下进行2-5分钟的干燥处理，加入12ulDEPC水，混合均匀后，做离心处理（2000rmp），之后将其置于冰上保存待检。为了预防PNase降低，在检查时需要在2小时内进行实时荧光定时扩增。

3.2 核酸提取柱方法

人类免疫缺陷病毒中的RNA提取柱时，需要严重按照操作说明书进行。操作方法如下：开始前，水浴锅加热至56℃,配制GBmix，其中CARRIERRNAASE浓度为1μg /Ul。向每份600μL血清中，加入10μL蛋白酶K，混匀，瞬时离心；加入600μLGBmix，混匀，瞬时离心，放于室温5min；加入600μL无水乙醇，混匀，瞬时离心，静置5分钟。将以上溶液分两次置入吸附柱中离心，常温8000rpn 30秒；在吸附柱中加入500μL的GD缓冲液，常温8000rpn 30秒；再向吸附柱中加入500μLPW漂洗液，操作两次常温8000rpn 30秒。将吸附柱12000rpn ，离心2min，之后用10μL的枪头，将残余的漂洗液吸出，室温晾干3分钟。在吸附柱中间的吸附膜上悬空加入43μLTB，室温静置5分钟，12000rpn ，离心2min。

在荧光定量PCR检测HIV病毒载量检测中，应严格按照检测要点进行核酸提取，以此来提高检测效果。